روشهاي آماده سازي نمونه براي الكتروفورز
محلول سازي
در نظر گرفتن ماهيت نمونه, در انتخاب راهکار مناسب براي محلول ساختن پروتئين هاي موجود در نمونه بسيار مهم است. در صورتيکه نمونه مورد نظر از منابع سلولي يا بافتي استخراج شود اولين قدم ليز سلولها و خارج ساختن محتواي پروتئيني آنهاست. روشهاي متفاوت مکانيکي و شيميايي درليز و متلاشي ساختن سلولها به کار گرفته مي شود. اين روشها ممکن است روش هاي ملايمي چون شکست ديواره ي سلولهاي باکتريايي توسط آنزيم لايزوزايم "Lysozyme", يا روشهاي خشني چون استفاده از پِرِس فرانسوي "French Press" براي متلاشي ساختن سلولهاي مخمري باشد.
به هر حال در روش مطلوبِ محلول سازي براي الكتروفورز دو بعدي بايد تمام پيوندهاي غيركوالانت در كمپلكسهاي پروتئيني شكسته شده و تجمع هاي پروتئيني به پلي پپتيدهاي منفرد و محلول تبديل شوند. به علاوه روش محلول سازي بايد اجازه ي خارج ساختن موادي نظير نمكها، ليپيدها، پلي ساكاريدها، و اسيدهاي نوكلئيك را كه مي توانند باعث اختلال درجداسازي توسط الكتروفورز دوبعدي شوند، بوجود آورد. درنهايت پروتئينهاي نمونه بايد درحين روند الكتروفورز دوبعدي محلول باقي بمانند. به همين دلايل محلول شدن نمونه يكي از عوامل بسيار حساس براي جداسازي پروتئينها توسط الكتروفورز دو بعدي است .
در اين قسمت ابتدا به روشهاي متداول در ليز و متلاشي ساختن سلولها به منظور استخراج محتواي پروتئيني آنها مي پردازيم. سپس اجزاي موثر در روند محلول سازي را مورد بررسي قرار خواهيم داد.
3-3-1- روشهاي متلاشي ساختن سلولها
روشهاي متلاشي ساختن سلولها به منظور استخراج محتواي پروتيني آنها, دامنه وسيعي از روش هاي فيزيکي و شيميايي ملايم تا خشن را در بر مي گيرد. ممکن است ليز سلولي به طور مستقيم در تماس با بافر محلول سازي صورت پذيرد يا در مواردي ممکن است از امواج مافوق صوت "Sonication" براي اين منظور استفاده شود. حتي در برخي موارد ترکيبي از روشهاي مختلف براي نيل به استخراج کامل پروتئين هاي نمونه استفاده مي گردد.
متلاشي ساختن نمونه ها بايد در سرما صورت پذيرد و نمونه مورد نظر در حين اين روند بايد روي يخ نگهداري شود. براي حفظ نمونه ي پروتئيني از عملکرد پروتئازهاي آزاد شده در حين متلاشي ساختن سلولها بايد تمهيداتي در نظر گرفته شود. يکي از روش هاي معمول متلاشي ساختن مستقيم سلولها در محلولهاي ليز کننده اي است که سريعا" پروتئازها و ديگر فعاليت هاي آنزيمي را متوقف کنند, اين محلولها عموما" داراي مواد دناتوره کننده ي قدرتمندي هستند.
بافرهاي محلول سازي
بافرهاي محلول سازي ممکن است به تنهايي يا در ترکيب با روشهاي ديگر متلاشي سازي سلولي به کار گرفته شوند. براي انجام جداسازي مناسب در بعد اول, نمونه هاي پروتئيني بايد بايد کاملا" غير توده اي و به صورت محلول باشند. اين امر براي تمامي انواع نمونه ها در هر مرحله اي از آماده سازي ضروري است. براي اين منظور معمولا", در ترکيب بافرهاي محلول سازي از يک يا دو معرف کائوتروپيک, دترجنت, معرف احيا کننده, و آمفولايت استفاده مي شود.
در اين قسمت به معرفي اين اجزا و نقش آنها در محلول ساختن و آماده سازي نمونه براي انجام الکتروفورز دو بعدي مي پردازيم.
3-3-2-1- معرفهاي کائوتروپيک
بسياري از پروتئين ها در اشکال طبيعي (Native) داراي چندين شكل فضايي مختلف هستند و به همين دليل ممکن است در الکتروفورز دو بعدي الگوهاي پيچيده اي ايجاد کنند. اين وضعيت تفسير نمايه هاي دو بعدي را دچار مشکل خواهد کرد. براي ساده تر کردن نمايه دو بعدي و حذف اثر شکل فضايي در ايجاد نقاط متعدد مربوط به يک پروتئين و ايجاد شکلي منفرد از آن, برهم زدن شکل طبيعي (Denaturing) توسط معرفهاي کائوتروپيک انجام مي شود.
اوره مهمترين عامل كائوتروپيك در آماده سازي نمونه براي الکتروفورز دو بعدي است که معمولاً با غلظت 8 مولار استفاده مي شود. اوره از دو طريق مستقيم و غير مستقيم باعث بر هم زدن شکل طبيعي و باز شدن تاخوردگي (Unfolding) مولکولهاي پروتئيني مي شود. مولکولهاي اوره مستقيما" جذب گروه هاي آب دوست (Hydrophill) و قطبي در سطح پروتئين ها مي شوند. اين مولکولهاي جذب شده به گروه هاي قطبي, اثر دفعي بر يکديگر دارند. بر اثر اين نيروي دفعي موجود در سطح, مولکول پروتئين باز شده و متورم مي گردد. همين امر گروه هاي آب گريز در سطوح داخلي پروتئين را در معرض محيط خارجي قرار مي دهد. ورود آب و اوره به محيط داخلي پروتئين سبب ايجاد بي ثباتي و برهم زدن شکل طبيعي پروتئين مي شود.
از طرف ديگر, اوره از طريقي غير مستقيم و با تغيير در ساختار و ديناميک آب مي تواند در برهم زدن شکل طبيعي پروتئين نيز موثر باشد. حضور مواد غير قطبي باعث اختلال در شبکه ي پيوندهاي هيدروژني بين مولکولهاي آب شده و ايجاد فضايي خالي در بين مولکولهاي آب مي نمايد, اين کاهش نامطلوب در انتروپي با فشار مولکولهاي آب به مولکولهاي آب گريز جبران مي شود تا کمترين فضاي ممکن را اشغال نمايند. اين پديده به اثر آب گريزي (Hydrophobic effect) موسوم است. اوره در غلظت هاي بالا, 8-6 مولار, نيروهاي موثر در متراکم کردن ساختمان پروتئين ها به خصوص اثر آب گريزي را کاهش مي دهد. بدين ترتيب به طور غير مستقيم قسمت هاي مرکزي آب گريز را در معرض و دسترسي عوامل محيطي قرار مي دهد.
زماني كه به شرايط كائوتروپيكي قوي نياز باشد ، تركيبي از تيواوره 2 مولار و اوره 8-5 مولار مورد استفاده قرار مي گيرد. تيواوره در مقايسه با اوره ماده ي دناتوره كننده ي بسيار قوي‌تري است. اما نمي توان آن را به تنهايي مورد استفاده قرار داد، چراكه حلاليت بسيار كمي در آب دارد. اين ماده در محلول غليظ اوره حلاليت بيشتري دارد. به همين دليل مخلوط هاي اوره ـ تيواوره قدرت محلول كنندگي بهتري را از خود نشان مي دهند. به علاوه اين تركيب قادر به جلوگيري از فعاليت آنزيمهاي پروتئوليتيك نيز هست كه در حضور اوره به تنهايي هم ممکن است فعّال باقي بمانند.
درجة خلوص اوره بسيار مهم است و بايد از حرارت دادن آن, به دليل تشكيل ايزوسيانات كه از تجزيه اوره حاصل مي شود، خودداري کرد. ايزوسيانات باعث كرباميلاسيون پروتئين ها و تشكيل نقاط غيرواقعي در الگوي نهايي دو بعدي مي شود. محلول حاوي اوره پايدار نيست و از ذوب و انجماد مكرر محلول حاوي اوره بايد خودداري كرد. از طرفي ديگر, اگرچه استفاده از تيواوره در نمونه باعث افزايش در بروز نقاط پروتئيني در نقشه پروتئيني مي شود اما ايجاد رگه هاي (Streaking) عمودي و نقاط مبهم و نامشخص در ناحية اسيدي ژل را نيز سبب مي شود كه هنوز راه حل مناسبي جهت حذف اين زوايد پيدا نشده است.
نتايج نويد بخش واکسن ژنتيکى مقابله با آلرژى
آزمايش هاى اوليه يک واکسن ضد آلرژى که پژوهشگران علوم پزشکى به کمک شيوه هاى مهندسى ژنتيک طراحى کرده اند،به نتايج اميدوارکننده اى منجر شده است .
نشريه بولتن بيوتکنولوژى ،وابسته به دفتر همکاريهاى فناورى و رياست جمهورى ،در شماره ۹۵ خود افزود : در جريان اين آزمايش ها،که در اتريش ، سوئد و فرانسه انجام شد،اين واکسن به طور چشمگيرى از حساسيت افراد مورد آزمايش به گرده گياهان کاست
اين گروه از پژوهشگران مىگويد،هم اکنون سرگرم توسعه واکسن هاى ژنتيکى ديگرى براى مقابله با انواع ديگر آلرژى هاست .
نتايج اين تحقيقات در نشريه "اقدامات آکادمى ملى علوم "منتشر شده است .
بنا به تخمين ها هم اکنون يک چهارم جمعيت جهان از نوعى آلرژى رنج مىبرند، که برخى از آنها مانند "آسم " ،جان بيماران را تهديد مىکند.
آلرژى اساسا ناشى از واکنش افراطى سيستم دفاعى بدن به ماده اى است که در واقع بىخطر است .
کار واکسن هايى که براى مقابله با بيماريهايى مانند سرخک يا فلج اطفال تجويز مىشود، اين است که سيستم دفاعى بدن را تحريک کنند.اما واکسن آلرژى بايد عکس آن را انجام دهد وبه گفته سرپرست اين گروه از پژوهشگران از دانشکده پزشکى وين ،شعله سيستم دفاعى بدن را پايين بکشد.
تيم تحقيقاتى به کمک مهندسى ژنتيک نمونه اى از گرده درخت غان را طراحى کرده است که در بدن افراد مبتلا به آلرژى ،پادتن هايى توليد مىکند که از شدت واکنش سيستم دفاعى بدن مىکاهد.
اين محصول همچنين از شدت واکنش سيستم دفاعى بدن به برخى از انواع ديگر گرده هاى آلرژى زا مىکاهد.
البته شيوه هايى براى درمان آلرژى که از همين اصول استفاده مىکند وجود دارد اما با اين که اين شيوه ها مىتواند کاملا موثر باشد اما گاه عوارض جانبى جدى به همراه دارد.
پژوهشگران دانشگاه وين به کمک مهندسى ژنتيک موفق شده اند ضمن حفظ تاثيراين شيوه هاى درمانى ،عوارض جانبى آنها را حذف کنند.
آنها همچنين نمونه هايى از ساير مواد الرژى زا را ساخته اند و قصد دارنداين مساله را که آيا اين مواد نيز به عنوان واکسن قابل استفاده هستند يا خير ،بررسى کنند.
قدمت نسخ خطی به کمک علم ژنتيک تعيين ميشود
محققان دانشگاه کمبریج موفق به ابداع شیوه‌ای برای تعیین قدمت و منشا دقیق نسخه‌های خطی قدیمی شده‌اند.
نسخه‌های خطی قدیمی اغلب روی پوست حیوانات نوشته می‌شده‌اند و محققان دانشگاه کمبریج با آزمایش نمونه Dna پوست، می‌توانند قدمت و منشا نسخه خطی را
مشخص کنند.
دکتر کریستوفر هو، استاد بیوشیمی دانشگاه کمبریج که سرپرستی این پروژه تحقیقاتی را به عهده داشته است، می‌گوید «با آزمایش نمونه Dna می‌توان
گونه جانوری که پوست متعلق به آن است را مشخص کرد. به این ترتیب اگر
برای مثال شما کتابی داشته باشید که در مورد منشا آن مطمئن نباشید،
می‌توانید با آزمایش Dna صفحات مختلف آن به اصالتش پی ببرید.
به گفته دکتر هو، این شیوه می‌تواند در مورد تمامی نسخ خطی به کار رود.
دکتر هو امیدوار است با تکمیل و بهبود این تکنیک، بتوان از آن برای
مشخص کردن منشا و اصالت بسیاری از نسخه‌های خطی که منشایی نامعلوم
دارند استفاده کرد.
متعادل سازي بعدهاي الكتروفورز
مقدار اضافه کردن نمونه
براي بدست آوردن بهترين قدرت تفكيك, بيشترين تعداد نقاط و كمترين رگه ها درژل, مقدار پروتئيني كه بر روي يك نوار "IPG" اضافه مي شود از اهميت زيادي برخوردار است. مناسب ترين مقدار نمونه اي که به نوار "IPG" اضافه مي شود با در نظر گرفتن عواملي نظير هدف مورد نظر, طول نوار يا فاصله جداسازي, ماهيت و تعداد پروتئين هاي موجود در نمونه, شيب pH ، و نيز روش رنگ آميزي مورد نظر, انتخاب مي شود.
براي مثال در صورتيکه نمونه اي حاوي مخلوط پيچيده اي از پروتئين ها باشد, بايد بر اساس هدف تجربه, مقدار اضافه کردن را انتخاب کرد؛ اگر هدف بررسي پروتئين هايي با فراواني کم باشد, بالطبع بايد مقدار نمونه بيشتري را اضافه نمود. در صورتيکه هدف بدست آوردن يک ژل زيبا و تميز براي درج در مقاله يا ارائه به صورت تصويري باشد, نشان دادن پروتئين هايي با فراواني بيشتر و اجتناب از ظهور رگه ها از اهميت بيشتري برخوردار خواهد بود, در نتيجه مي توان مقادير کمتري از نمونه را به نوار "IPG" اضافه نمود. يا در زمانيکه از نوارهايي با محدوده ي pH کوچک استفاده مي شود, مي توان مقادير بيشتري از نمونه را به کار برد چرا که بعد از "IEF" فقط پروتئين هايي با pI داخل اين محدوده در نوار باقي ميمانند و در بعد دوم ظاهر مي شوند.
به هر حال, ميزان نمونه اي که اضافه شود مي توانــد از چنــدين ميکروگرم تا چند ميــلي گرم متغيــر باشــد.
اگر غلظت پروتئيني نمونه ناشناخته باشد, براي دستيابي به تخميني حدودي و سريع از غلظت نمونه, مي شود با تهيه رقت هاي متوالي از نمونه و نيز از يك محلول پروتئيني استاندارد با غلظت مشخص, آنها را روي غشا نيتروسلولز نقطه گذاري كرد و بعد با آمينوبلك يا كوماسي بلو رنگ آميزي كرد. مقايسه شدت رنگ رقت هاي استاندارد با نمونه, محک قابل قبولي براي تخمين حدودي از غلظت نمونه خواهد بود.
درعمل بهترين زمان فوكوسينگ موردنياز براي رسيدن به بهترين كيفيت و تكرارپذيري, زماني است كه تمام پروتئين هاي داخل نمونه در pI خود متمرکز شده باشند. در "IEF" معمولا" واحد ساعت ولت که حاصل ضرب ولتاژ اعمال شده در زمان بر حسب ساعت است, مورد استفاده قرار مي گيرد. اگر ساعت ولت "IEF" به اندازة كافي نباشد, معمولاً رگه هاي افقي در نمايه ي دو بعدي ظاهر مي شوند. از طرف ديگر بايد از فوكوس شدن بيش از حد نيزخودداري شود, چرا که در "IPG", برخلاف متد كلاسيك "O’Farell", فوكوسينگ بيش از حد منجر به مهاجرت پروتئينها به سمت كاتد نمي شود, بلکه اين امر منجر به تراوش بيش از حد آب درسطح ژلهاي IPG ناشي از انتقال فعال آب مي شود كه به اين پديده جريان الكترواندوسموتيك معكوس مي گويند. در نتيجه نمايه واقعي ژل تخريب و دستخوش تغيير مي گردد, رگه هاي افقي در انتهاي بازي ژل پديدار شده و احتمالاً برخي از پروتئينها نيز از دست مي روند. براي حل اين مشكل علاوه بر کاهش زمان فوکوسينگ بايد حتما" سطح "IPG" در حين فوکوسينگ از روغن معدني پوشيده باشد.
به هر حال زمان فوكوسينگ بهينه بصورت تجربي براي هر نمونه ي پروتئيني و با در نظر گرفتن ميزان پروتئين اضافه شده, محدودة pH بكار گرفته شده و حتي طول انتخاب شده براي نوارهاي "IPG", تعيين مي شود.
4-6- انتخاب شيب pH براي ايزوالكتروفوكوسينگ با IPG
معمولاً براي آناليز اوليه ي يك نمونه ي جديد از شيب pH با محدوده ي وسيع،10-3، استفاده مي شود. در بسياري از نمونه ها استفاده از شيب pH 10-3 باعث از دست دادن قدرت تفكيك در محدوده ي pH 7-4 مي شود، محدوده اي که نقطة ايزوالكتريك بسياري از پروتئينها در آن قرار دارد. براي غلبه نسبي بر اين مشكل استفاده از "IPG" با شيب pH غيرخطي 10-3 توصيه مي شود .كه در آن ناحيه ي pH 7-4 داراي شيب کمتري در مقايسه با شيب ناحيه ي 10-7 است. با اين کار نه تنها جداسازي خوبي در ناحية pH 7-4 خواهيم داشت, بلکه اغلب پروتئين هاي بازي نيز به خوبي از همديگر تفكيك مي شوند. استفاده از نوار "IPG" با شيب pH 7-4 حتي منجر به جداسازي بهتر پروتئين ها در اين ناحيه مي شود. نوارهاي "IPG" تجاري براي اين محدوده هاي pH قابل خريداري هستند. البته مي توان از "IPG" هاي دست ساز در آزمايشگاه نيز استفاده كرد كه بيشتر پروتئينهاي سلولي را براي بسياري از انواع نمونه ها تحت پوشش قرار دهد.
در نمونه هاي پيچيده نظير نمونه هايي كه از سلولهاي اوكاريوتيك گرفته مي شوند، انجام الكتروفورز دوبعدي بر روي يك شيب pH با محدودة گسترده, فقط درصد كمي از كل پروتئوم را نشان مي دهد چراكه قدرت تفكيك فضايي ناكافي است و همين مسئله نمايان سازي پروتئينهايي كه داراي نسخه هاي كمتري هستند را درحضور گونه هايي که فراواني بيشتري دارند، با مشكل مواجه مي کند. يك راه براي غلبه بر مشكل محدودة ديناميك بالا و گوناگوني پروتئينهايي که در بافتهاي اوكاريوتيك بيان مي شوند از پيش جز به جز کردن نمونه ها است. راه بسيار موثر ديگر استفاده از چندين نوار "IPG" با محدوده هاي کوچک(واحد pH 5/1-1) است، به طوري كه اين محدوده ها همديگر را بپوشانند. اين روش به ژلهاي درشتنما Zoom Gels يا ژلهاي كامپوزيت يا ژلهاي ساب پروتئوميكس موسوم است. در نهايت افزودن فاصله جداسازي تا 24 سانتيمتر هم مي تواند براي حل مشکل فوق مورد استفاده واقع شود.
"IPG" هاي با محدوده هاي کوچک و نيز"IPG" با pH 7-4 با هر دو شيوة بارگيري نمونه توسط پياله هاي بارگيري و نيز بارگيري در حين خيساندن ژل سازگار هستند. اين ژلها براي نمونه هايي با غلظت در حد ميکرو ايده آل هستند, اما نياز به افزايش زمان فوكوسينگ دارند.
نمايه هاي دوبعدي مجازي كه از روي توالي هاي ژنومي محاسبه شده‌اند، نه تنها نشان مي دهند كه اغلب پروتئينهاي يك سلول ليزشده داراي pI بين pH 9-4 هستند، بلكه بيانگر اين نکته اند كه تعداد قابل توجهي از پروتئينها با pI بالاتر از pH 12 نيز وجود دارند. مثلا" پروتئينهاي نوكلئار يا ريبوزومي پروتئينهاي شديدا" بازي با pI نزديك به هم هستند,. اين پروتئين ها با استفاده از IPG هاي با محدودة كوچك pH: 12-10يا pH 12-9 قابل جدا شدن هستند. در الكتروفورز دوبعدي كلاسيك که از آمفولايت استفاده مي شد, پروتئينهاي بازي فقط توسط "NEPHGE" از همديگر جدا مي شدند، اما اينک به راحتي با استفاده از "IPG IEF" جداسازي مي شوند. براي اين منظور استفاده از محدوده ي کوچک pH 12-10 يا pH 12-9 توصيه مي شود.
براي بدست آوردن تكرارپذيري بالا در الکتروفورز دوبعدي, مراحل بهينه سازي مختلفي با توجه به pH و تركيب ژل مورد استفاده قرار مي گيرند. براي مثال در زمان استفاده از "IPG" هاي بازي به منظور جلوگيري از ظهور رگه هاي افقي متعدد در نمايه ي ژل دو بعدي, که ناشي از جريان الكترواندوسموتيك معكوس است، مي توان از يك كاغذ ----- اضافي كه در "DTT" غوطه ور شده بر روي سطح نوار "IPG" درطول الكترود كاتدي استفاده کرد. "DTT" آزاد شده از اين نقطه بر روي نوار, جايگزين "DTT" موجود در ژل مي شود كه به سمت آند در حين IEF مهاجرت مي كند و خارج مي شود. راه حل ديگر براي ممانعت از ايجاد رگه هاي افقي استفاده كردن از "TBP" است. اين عامل احياء كننده ي بدون بار الكتريكي, درحين ايزوالكتروفكوسينگ به سمت آند مهاجرت نمي كند. ديگر روشهاي مقابله با اين مشکل استفاده کردن از اِن، اِن دي متيل آکريل آميد به جاي آكريل آميد , اضافه کردن ايزوپروپانل به محلول مخصوص خيساندن "IPG"، همچنين بارگيري نمونه در آنود توسط پياله بارگيري، و استفاده از روغن معدني براي پوشاندن نوارهاي "IPG" در زمان ايزوالکتروفوکوسينگ است.
4-7- متعادل سازي بين بعدهاي الكتروفورز:
بعد از "IEF" نوارهاي "IPG" را مي توان فوراً به بعد دوم انتقال داد. در عين حال مي توان اين نوارها را بين دو ورقة پلاستيكي و در80- درجه سانتي گراد به مدت چندين ماه نگهداري كرد. قبل از جداسازي دربعد دوم بايد ژلهاي الكتروفوكوس شده متعادل شوند. اين کار براي ورود "SDS" به ژل و واكنش كامل پروتئين ها با "SDS" صورت مي گيرد به طوري که مهاجرت پروتئين ها از "IPG" به "SDS-PAGE" امکان پذير گردد.
براي اين كار نوارهاي ژل "IEF" به مدت 15 دقيقه در بافر تريس 50 ميلي مولار که حاوي 2% "SDS" ، 1% "DTT", 6 مولار اوره و 30% گليسرول است, قرار داده مي شوند. اوره و گليسرول براي كاهش اثرات الكترواندوسموتيك بكار برده مي شوند كه عدم بكار بردن آنها منجر به كاهش انتقال پروتئين از بعد اول خواهد شد. پس از اين كار, متعادل سازي 15 دقيقه ي ديگر در محلولي مشابه كه حاوي 5% آيودواستامايد به جاي "DTT" است, ادمه مي يابد . اين مرحله براي آلكيله كردن گروه هاي SH در پروتئين هاي محلول و ممانعت از ايجاد پيوندهاي دي سولفيدي بين آنها در حين الکتروفورز صورت مي پذيرد. مقدار اضافي آيودواستامايد نيز در آلکيله کردن "DTT" هاي آزاد مصرف مي شود. در صورت حضور"DTT" هاي آزاد در نوار ژل, آنها در طي بعد دوم داخل ژلهاي "SDS-PAGE" مهاجرت مي كنند و منجر به ايجاد آلودگيهايي مي شوند كه به عنوان رگه هاي نقطه اي شناخته شده اند و پس از رنگ آميزي با نيترات نقره قابل مشاهده هستند (شکل 4-7) .
روش جايگزين ، انجام متعادل سازي در يك مرحله است كه در آن "DTT" موجود در بافر متعادل سازي با 5 ميلي مولار "TBP" جايگزين مي شود, چون "TBP" داراي بار الكتريكي نيست و در طي "SDS-PAGE" نيز مهاجرت نمي كند.
نوارهاي "IPG" پس از متعادل سازي بايد کاملا" خشك شوند, يعني گوشة آنها بر روي كاغذ ----- به مدت 1 دقيقه نگه داشته مي شود تا قبل از اينكه به بعد دوم بروند, مايع اضافي از آنها گرفته شود.
نکته قابل توجه اين است که با استفاده از روش رايج متعادل سازي, يعني استفاده از "DTT" و آيودواستامايد, ممکن است دو نوع مشتق آلکيله از سيستئين به وجود آيد, يکي کربوکسي آميدو متيل – سيستئين ناشي از عملکرد آيودواستامايد در حين متعادل سازي و ديگري سيستئين – پروپيونامايد ناشي از واکنش با آکريل آميد مونومر باقي مانده در ژل " . SDS-PAGE" درحين بعد دوم. در صورت استفاده از آکريل آميد براي آلکيلاسيون, تنها يک مشتق آلکيله از سيستئين (سيستئين پروپيوناميد) در الکتروفورز دو بعدي به وجود خواهد آمد. اين مسئله به عنوان يک مزيت در تعيين هويت با طيف سنجي جرمي تلقي مي گردد, چرا که با حذف امکان ايجاد مشتق هاي آلکيله متفاوت از سيستئين در يک پروتئين, از سردرگمي در حين تعيين هويت ممانعت به عمل مي آورد
ددت و تاثیر آن بر محیط زیست
نگاه کلی
تا قبل از سالهای 1970 که استفاده از ددت در اکثر کشورهای پیشرفته ممنوع اعلام شد، ددت یک حشره‌کش ایده‌آل بنظر می‌رسید. برای انسان سمی نبود، اما برای حشرات بسیار سمی و کشنده بود. پیش از ددت اکثر حشره‌کش‌ها از ترکیبات آرسنیک بودند که بسیار سمی و پردوام و برای انسان خطرناک بودند.
در جنگ جهانی اول ، بیش از 5 میلیون نفر بعلت تیفوس جان سپردند که برای جلوگیری از چنین مصیبتی نیروهای متمدن که از اهمیت ددت برای نابود کردن حشرات ناقل امراض در هوای گرم آگاه بودند، با سمپاشی اردوگاه‌های نظامی و اردوگاه اسیران بوسیله ددت ، از شیوع تیفوس و مالاریا و سایر امراض که بوسیله حشرات انتقال می‌یابد، جلوگیری کردند.
تاریخچه
ددت بعنوان حشره‌کش در سال 1939 توسط پاول مولر ، شیمیدانی که در زمینه توسعه مواد شیمیایی برای مبارزه با حشرات کشاورزی فعالیت می‌کرد، کشف شد. مولر در سال 1948، جایزه نوبل در طب و فیزیولوژی را بخاطر اینکه جان بسیاری از انسانها را پس از جنگ بوسیله ددت نجات داد، دریافت کرد. پس از پایان جنگ جهانی دوم ، از ددت برای استفاده‌های بهداشتی در مناطقی با آب و هوای گرم استفاده شد.
همچنین بطور گسترده در کشورهای پیشرفته بعنوان حشره‌کش در باغها ، مزارع پنبه و سبزیجات استفاده شد. تا اینکه بدلیل مقاوم شدن برخی حشرات در مقابل ددت و استفاده بی‌رویه کشاورزان در مزارع برای افزایش تاثیر آن و پیدا شدن ترکیبات سمی ددت در بافت چربی پرندگان و ماهی‌ها نگرانیهای وسیعی میان مردم و دولتها در مورد استفاده از ددت پدید آمد تا سرانجام در سال 1973، سازمان حفاظت از محیط زیست تمام کاربردهای ددت را بجز مصارف ضروری برای بهداشت عمومی ممنوع کرد.
ساختار ددت
ددت یا پارا - دی‌کلرو دی‌فنیل تری‌کلرواتان ، از نظر ساختاری یک اتان استخلافی است. در یکی از اتمهای کربن ، هر سه اتم هیدروژن بوسیله اتمهای کلر جانشین شده‌اند در حالیکه در اتم دیگر کربن ، دو اتم از سه اتم هیدروژن بوسیله حلقه فنیل (بنزن) استخلاف یافته‌اند و در هر حلقه ، یک اتم کلر در موقعیت پارا یعنی درست در مقابل اتم کربن حلقه که واحد اتان متصل است، قرار دارد.
خواص شیمیایی ددت
ددت جزء حشره‌کش‌های آلی کلردار است. این آفت‌کش‌های کلردار دارای چندین خاصیت مشترک هستند.
پایداری در برابر تجزیه شدن یا تخریب شدن در محیط زیست
انحلال‌پذیری بسیار کم در آب ، مگر اینکه ترکیب آنها حاوی اکسیژن یا نیتروژن باشد.
انحلال‌پذیری بالا در محیط‌های زیست هیدروکربن مانند بافت چربی جانوران
سمیت نسبتا بالا برای حشرات و سمیت کم برای انسان
فشار بخار ددت پایین و در نتیجه ، سرعت تبخیر آن کم است. در برابر نور و مواد شیمیایی در محیط زیست واکنش‌پذیری کمی دارد و انحلال‌پذیری آن در آب بسیار کم است. در حلالهای آلی بخوبی حل می‌شود. ددت در فرایند سوخت و ساز بسیاری از گونه‌های حیوانی با حذف شدن HCl شرکت می‌کند و مشتقی از اتن به نام دی کلرو دی‌فنیل دی‌کلرو اتن (DDE) را بوجود می‌آورد که بسیار مقاوم و از لحاظ زیستی تخریب ناپذیر است.
مکانیسم اثر ددت
مکانیسم اثر ددت بیشتر ناشی از شکل مولکولی آن است تا بعلت برهمکنش شیمیایی با گونه‌ای خاص ، ددت و سایر هم رده‌های آن به شکل سه‌بعدی در تونل عصبی حشره ، مانند گره قرار می‌گیرند. این تونل بر حسب ضرورت ، تحریکها را از طریق یون‌های سدیم منتقل می‌کند اما وقتی مولکول ددت این تونل را باز نگه می‌دارد، یک ردیف پیوسته از تحریکهای عصبی که آغازگر آنها است باعث انقباض عضلات حشره و تشنج و مرگ آن می‌شود.
جایگزین‌های ددت
به علت آلودگی محیط زیست و تجمع ددت در بافتهای حیوانی و مقاوم شدن حشرات در برابر ددت (با تبدیل ددت به DDE و غیر فعالسازی آن) ، مصرف آن بجز برای مصارف بهداشتی ضروری ممنوع شده است. اما دانشمندان ترکیباتی ساخته‌اند که اندازه و شکل آنها مشابه ددت است و همان خواص حشره‌کشی را دارد، با این تفاوت که در حد قابل قبولی از لحاظ زیستی تخریب‌پذیرند و در موجودات زنده هم بجای تجمع ، دفع می‌شوند. بهترین نمونه این ترکیبات متوکسی کلر است که بطور گسترده در مصارف خانگی و کشاورزی برای مهار پشه و مگس بکار می‌رود.
