کاربرد بیوتکنولوژی در کشت گیاه داوودی
- کشت بافت و کاربرد آن در داودي
1- تكثير از طريق كشت بافت
1-1- محيط كشت و ريزنمونه
براي تهيه ريز نمونه در داودي از برگهاي جوان نيمه باز با رنگ سبز روشن به طول 5-2 سانتي متر استفاده شده است. ضد عفوني کردن برگهاي رشد يافته در شرايط گلخانه با هيپوکلريت سديم 5% حجمي/ حجمي به مدت 5 تا 10 دقيقه و ضد عفوني کردن برگهاي گياهان رشد کرده در شرايط مزرعه با هيپوکلريت سديم 10% حجمي/ حجمي انجام گرديد.
ريز نمونه هايي به اندازه 2/1-1 سانتي متر مربع از قطعات برگي يا تک گره تهيه مي شوند. محيط کشت پايه استفاده شده شامل MS پايه (Murashige and Skoog, 1962) با نمکهاي پايه به اضافه 30 گرم در ليتر ساکارز، 1 گرم در ليتر ميوانيوسيتول، 5 ميلي گرم در ليتر تيامين HCl و همراه با 8 گرم در ليتر آگار و 7/5=pHمي باشد محيط کشت استريل شده در پتري هاي 15 * 60
ميلي متري توزيع مي شود. تنظيم کننده هاي رشد با توجه به هدف آزمايش تهيه و در محيط کشت اضافه مي شود.
باززايي شاخساره هاي نابجا از كالوس هاي حاصل از ريز نمونه هاي برگ و ساقه دو رقم تجاري داودي به نامهاي Chrysanthemum morifolium cv. Brietner (بنفش چوب بستي) و Chrysanthemum morifolium cv. Marion (كرم) در دو نوع محيط رشد مورد مطالعه قرار گرفت. محيط رشد باززايي هر دو رقم، محيط پايه MS به همراه هورمون NAA (1/0 تا 25/0 ميلي گرم در ليتر) و BA (2 ميلي گرم در ليتر) در نظر گرفته شد. نتايج نشان داد در بيشتر موارد درصد باززايي ريز نمونه ساقه نسبت به برگ (در هر دو رقم) بيشتر بوده است. رشد و ريشه دهي گياهچه هاي حاصل از باززايي هر دو رقم بطور همزمان در محيط MS انجام گرفت. بيشترين ميزان توليد كالوس از ريزنمونه هاي برگ به طول 5/1 – 2 سانتيمتر روي محيط MS حاوي 5 ميلي گرم BAP و 5/0 ميلي گرم در ليتر كينتين بدست آمد. در محيط MS حاوي 2/0 ميلي گرم در ليتر IBA ريشه زايي به ميزان 100% صورت گرفت.
باززايي شاخساره از قطعات گره (Nodal segment) و نوك شاخساره (Shoot tip ) به ترتيب در محيط MS حاوي 0/1 ميلي گرم در ليترBAP و ريشه زايي در محيط MS حاوي 2/0 ميليگرم در ليتر IBA به ميزان 95% و 91% موفقيت آميز بوده است.
از نوك شاخساره و قطعات تك جوانه نيز براي تكثير سريع داودي استفاده شده است. بيشترين ميزان تکثير در محيط MS حاوي 30 گرم در ليتر ساكارز و 0/1 ميلي گرم در ليتر BAP، 2/0 ميليگرم در ليتر NAA و 10 ميلي گرم در ليتر اسيد جيبرليك حاصل شده است. ريشه زايي در زمان كوتاهي ( حدود 5 روز) روي محيط MS حاوي 0/1 ميليگرم در ليتر IAA صورت مي گيرد.
همچنينازدياد داودي از طريق كشت مريستم انتهايي نيز بر روي محيط MS حاوي Kin (2-0 ميلي گرم در ليتر)، NAA (2-0 ميلي گرم در ليتر) به تنهايي يا در ترکيب با يکديگر مورد بررسي قرار گرفت و نتايج اين بررسي نشان داد كه بيشترين وزن تر كالوس (2096 ميلي گرم در هر لوله آزمايش) در غلظت 1 ميلي گرم در ليتر NAA به همراه 5/0 ميلي گرم در ليتر Kin حاصل مي شود، در حالي كه در كشتهاي فاقد هورمون وزن تر كالوس 20 ميلي گرم ارزيابي گرديد. اگر چه تمايز ريشه و شاخساره در محيطهاي حاوي NAA و يا Kin وجود دارد. ولي با اين حال در محيطهاي حاوي هورمون NAA تمايز ريشه و در محيطهاي حاوي Kin سرعت رشد شاخساره بهترمي باشد. آزمايشات نشان داده كه ريز نمونه هاي ساقه و برگ داودي نسبت به هورمون NAA در مقايسه با هورمون BAP حساسيت و واكنش بيشتري نشان مي دهند. بالاترين درصد باززايي شاخساره از گلچه هاي داودي، در تركيب هورموني NAA با BAP و IAA با BAP گزارش شده است. در اين بررسي تركيب هورموني IAA با Kin، تاثير معني داري در باززايي شاخساره نداشته است.
1-2- مرحلة فيزيولوژيكي گياه و زمان کشت
ريزنمونه هاي جوان ساقه داودي (تهيه شده از گياه 9 هفته اي) در مقايسه با ريز نمونه هاي مسن تر (تهيه شده از گياه 19 هفته اي) توليد شاخساره بيشتري در محيط کشت نشان ميدهند. علاوه بر اين باززايي شاخساره ريزنمونه هاي تهيه شده در فصل زمستان در مقايسه با بهار و تابستان بيشتر مي باشد.
براي بررسي زمان کشت، مريستم انتهايي داودي بطور ماهيانه، در فاصله بين مهر تا ارديبهشت در شرايط آزمايشگاهي مورد كشت قرار گرفت و مشاهده شد كه استقرار ريز نمونه هاي تهيه شده بعد از مهر ماه كاهش نشان مي دهد بطوريكه در دي ماه به كمترين ميزان خود مي رسد. استقرار ريز نمونه هاي تهيه شده در فاصله بين فروردين تا ارديبهشت عموماً 100 درصد مي باشد. همچنين در سرعت رشد ريز نمونه هاي تهيه شده در فصل بهار يك افزايش تدريجي مشاهده مي شود. باززايي آن دسته از ريز نمونه هاي انتهايي ساقه داودي كه در فاصله بين فروردين تا ارديبهشت ماه تهيه و كشت شده بودند، فاقد مرحله كالزايي نشان داده شد، در حالي كه ريز نمونه هاي تهيه شده در زمانهاي ديگر، اغلب مرحله كالزايي نيز نشان مي دادند.
1-3- اثر نور و دما
در مورد كشت بافت داودي، همواره استفاده از نور لامپ فلورسنت سفيد در يك تيمار نوري 16 ساعت روشنايي به همراه 8 ساعت تاريكي توصيه شده اشت. البته در بعضي موارد گزارشاتي مبني بر استفاده از 15 ساعت روشنايي به همراه 9 ساعت تاريكي نيز وجود دارد. شدت نور مورد استفاده نيز بين 3000 تا 4000 لوكس گزارش شده است.
در اغلب گزارشات، دماي مورد نياز براي رشد و نمو ريزنمونه ها ي در داودي، 22 تا 26 درجه سانتيگراد ذکر شده است.
2- كشت مريستم و توليد گياه عاري از ويروس
اعمال تيمار گرمايي 38-35 درجه سانتيگراد بر روي گياهان داودي در شرايط گلخانه اي به مدت 4 الي 37 هفته و سپس كشت مريستم منجر به توليد داودي هاي عاري از ويروسهاي virusB, vein mottle, greenflower aspermy, stunt شده است. مقايسه توليد گياهچه هاي عاري از بيماري از ريزنمونه هاي مريستم در دو حالت پيش تيمار گرمايي (37 درجة سانتيگراد به مدت 8 هفته) و بدون پيش تيمار گرمايي از جوانه هاي جانبي
(lateral shoot) با طول 4/0- 5/0 ميلي متر و روي محيط MS تغيير يافته صورت گرفت و مشاهده شد که مريستم هاي حاصل از تيمار گرمايي رشد سريعتر و بقاء بهتري نشان مي دهند. 93% از مريستم هايي كه تيمار گرمايي ديده بودند شروع به پر آوري کردند در حالي كه اين ميزان در مريستم هاي تيمار نشده 6/83% بود. همچنين ريشه زايي در شاخساره هاي حاصل از گياهان تيمار شده خيلي زودتر شروع گرديد. گياهچه هاي ريشه دار شده به گلدانهاي حاوي پيت موس و پرلايت منتقل شدند.
3- جنين زايي سوماتيكي
توليد جنين هاي سوماتيكي داودي در ريزنمونه هاي برگ 12 رقم از مجموع 23 رقم مورد بررسي روي محيط MS حاوي 2,4-D و BA مشاهده گرديد اما فقط باززايي 5 رقم موفقيت آميز بود.
همچنين جنين زايي سوماتيكي از ريزنمونه هاي گلبرگهاي شعاعي Dendranthema grandiflorum kitamura روي محيط MS حاوي غلظتهاي بالاي IAA و Kinetin صورت گرفت. در اين آزمايش استفاده از NAA منجر به جنين زايي گرديد اما استفاده ازIBA و 2,4-D بر روي جنين زايي تاثيري نداشت. سيتوكنين هاي BAP و Thidiazuron نيز در ايجاد جنين زايي مؤثر نبودند. همچنين در غلظتهاي پايين IAAهمراه با Kinetin و غلظتهاي مختلف BAP جنين زايي صورت نگرفت. البته در غلظتهاي بالاي BAP تعداد زيادي شاخساره نابجا توليد گرديد. در ريزنمونة برگ، هيچ كدام از تركيبات تنظيم كننده هاي رشد مورد استفاده، منجر به جنين زايي نگرديد.
جنين زايي سوماتيكي ريز نمونه هاي برگ داودي تحت تاثير دو فاكتور نور و ساكارز، بر روي محيط اصلاح شده موراشيگ و اسكوگ (MSB) حاوي 1 ميلي گرم بر ليتر 2,4-D به همراه 2/0 ميلي گرم بر ليتر BA، مورد مطالعه قرار گرفت و مشاهده شد ريز نمونه هايي كه بر روي محيط حاوي 9 تا 18 درصد ساكارز، در شرايط 28 روز تاريكي در ابتدا و به دنبال آن 10 روز روشنايي و برگشت دوباره آن به 14 روز تاريكي قرار مي گيرند جنين زايي نشان مي دهند. بيشترين ميزان جنين زايي، در غلظتهاي 12 تا 15 درصد ساكارز مشاهده مي شود و غلظتهاي كمتر ساكارز عمدتاً بر روي نمو ريشه و شاخساره ها موثر مي باشند.
