بیماری تیلریوز Theileriosis ( بيماري دامي ) !!

یماری تیلریوز یكی از معضل های مهم پیشرفت در صنعت دامداری در اكثر نقاط جهان میباشد . انگلهای تیلریا ‏T. annulata و T. parva مهمترین گونه های اقتصادی و مسئول تلفات و كاهش تولید تخمین زده شده اند.
استراتژی مراقبت از بیماری تیلریوز در بیشتر كشورها بوسیله كنترل ناقلین بخصوص كنه ها میباشد. اما كنترل كنه ها نسبت به روشهای دیگر كنترل این بیماری از اهمیت كمتری برخوردار میباشد زیرا اولا كنه كش ها ( سموم Acaricide ) گران تمام میشوند و ثانیا مقاومت بر علیه اكثر آنها ایجاد شده است. در ضمن مدیریت حمل ونقل و قرنطینه دام بطور جدی قابل اجرا نمی باشد. از دیگر روشهای كنترل بیماری استفاده گسترده از واكسیناسیون میباشد. درمان داروئی معمولا با Parvaquone, Buparvaquone, Halofuginone, برای هر دو گونه ‍T. parva, T. annulata موثر میباشد. اما این درمانها دام مبتلا را مبرا از آلودگی Sterilise نمیكنند.


●واكسنهای مورد لزوم :
برای تهیه واكسن برای T. annulata از تیره سلولی شیزونت Schizont-infected cell lines استفاده میشود. این واكسن كه حاوی سلولهای شیزونتی میباشد باید تا كمی قبل از مصرف در دمای انجماد نگهداری شود.
برای واكسینه كردن دامها بر علیه T. parva از روش آلوده كردن و درمان استفاده میشود. بصورتیكه مقداری كنه آلوده جمع آوری شده از روی بستر را چرخ كرده و عصاره آنرا زیر پوستی تزریق میكنند و بلا فاصله بطور همزمان درمان با تتراسیكلین را شروع میكنند. معمولا یك عفونت خفیف یا پنهان ایجاد میشود كه با پاسخ ایمنی كنترل میشود.


●تشخیص بیماری و مشخصات انگل :
تشخیص بیماری وابسته به علائم كلینیكی ، شناختی از شدت بیماری و گستردگی ناقلین یا كنه ها و بررسی لامهای تهیه شده ( گسترش خون و یا گسترش غدد لنفاوی ) میباشد. غیر از فرمهای مختلف داخل گویچه قرمزی در گسترشهای خونی، شیزونت مشخصه مهم و خوبی در آلودگی با گونه های ‏T. Parva و T. annulata درگسترشهای تهیه شده از غدد لنفاوی میباشد. سلولهای آلوده ممكن است در گسترشهای فشاری Impression smears تمام بافتها دیده شوند

.
●بیماریزایی: شیزونت گونه T. parva ابتدا در مرحله پاتوژنیك باعث افزایش سلولهای سیستم لنفاوی Lymphoproliferative شده و بعد از آن باعث تخریب سلولهای فوق Lymphodestructive میشود. حیوان مبتلا دارای علائم تورم غدد لنفی، تب، مقداری افزایش تنفس، تنگی نفس و گاهی اسهال میباشد. ضایعات بعد از مرگ شامل تورم و پرخونی غدد لنفاوی، ذات الریه بینابینی Interstitial pneumonia و ادم مابین لبی interlobular oedema ، ضایعات تخریشی erosion , ulcer در شیردان و التهاب روده بهمراه نكروز غدد پیرز peyer´s patches و در حالتهای طولانی تر نفوذ سلولهای لنفاوی lymphocytic infiltration به كلیه ها كه شبیه سكته كلیوی infarct بنظر آمده و یا بهمراه ترمبوز و ischaemic necrosis میباشد. در حیوانات بهبود یافته گاهی در اثر عود بیماری سندرم عصبی چرخش Turning sickness دیده می شود.

خصوصیات بیماری زایی در اثر شیزونت T. annulata تقریبا شبیه ‍T. parva می باشد ولی مرحله پیروپلاسمی ممكن است پاتوژنیك تر بوده و باعث كم خونی و زردی شود.

●تكنیكهای تشخیصی :
تیلریا انگل تك یاخته أی اجباری داخل سلولی تمام خانواده گاوهای وحشی و اهلی ( Bovidae ) در جهان میباشد. و بعضی از گونه ها نشخواركنندگان كوچك را نیز مبتلا می نماید. بوسیله كنه های خانواده Ixodidae منتقل میشوند و دارای زندگی پیچیده ای در مهره داران و بی مهره ها میباشند. شش گونه تیلریا گاو را آلوده میكند كه دو تا از آنها بیماری زایی بیشتری دارند : اولی بنامT. parva كه بیماری East coast fever , Corridor disease , Zimbabwean theileriosis را ایجاد و دومی T. annulata باعث بیماری Tropical theileriosis میشود.
دیگر گونه ها كه شامل T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. taurotragi, T. mutans هستند معمولا بیماری زایی خفیفی ایجاد میكنند. گونه T. velifera غیر بیماری زا است. اغلب این گونه ها پس آلوده كردن دام ایجاد دام ناقل در دامهای بهبود یافته را مینمایند اما هیچ نوع داده وآماری در رابطه با رل این ناقلین در انتقال بیماری در حالت طبیعی وجود ندارد.
گاوهای بومی درمناطق بومی آلوده ممكن است بیماری را تحمل نموده و یا به بیماری خفیف و تحت كلینیكی مبتلا شوند. اما گاوهای غیر بومی حسا س بوده و در صورت ابتلا علائم شدیدی نشان داده و یا تلف می شوند.
همانطوریكه قبلا هم گفته شد شیزونت ها در گسترش تهیه شده از غدد لنفاوی مشخصه خوبی برای آلودگی با T. parva, T. annulata میباشد. شیزونت گونه T. taurotragi در گسترش رنگ آمیزی شده بوسیله گیمسا بخوبی قابل تشخیص نمیباشد.
شیزونت T.mutans نسبت به شیزونت T. parva دارای هسته های بزرگتر، مسطح وبی قاعده میباشد.
فرم پیروپلاسمی T. parva , T. annulata و T. mutans شبیه بهم میباشد. اما معمولا T. annulata , T. mutans بزرگتر و اغلب در حال تقسیم دیده میشود. T. velifera ممكن است بوسیله یك پرده حجاب مانند تشخیص داده شود

.
●تشخیص سرولوژیكی :
تشخیص وجود پادتن بصورت غیر مستقیم بوسیله IFA ( indirect fluorescent antibody)
بطور گسترده برای تشخیص گونه های مختلف تیلریا بكار می رود. تشخیص نوع آلودگی بخصوص آلودگی با ‍T. parva چندان در بین روشهای ایمنولوژی قابل تمایز نمی باشد. بهترین روش سرولوژی قابل تمایز مابین گونه های تیلریا آزمایش غیر مستقیم پادتن فلورسانس IFA ( Indirect Fluorescent Antibody ) می باشد. در این آزمایش هر دو مرحله شیزونت و پیروپلاسمی بوسیله لام تهیه شده و یا در محلول قابل بررسی می باشند. برای نگهداری محلول یا لامهای تهیه شده در مرحله شیزونتی دمای انجماد (۲۰- تا ۷۰- ) استفاده میشود ولی در مرحله پیروپلاسمی برای نگهداری محلول از دمای ۴ درجه یخچال و برای لامها از دمای انجماد میتوان استفاده كرد.
سرمهای مورد آزمایش را با ماده bovine lymphocyte lysate رقیق میكنند و با محلول آنتی ژنی در انكوباتور میگذارند و بعد ضد ایمنوگلوبولین متصل گاوی anti-bovine immunoglubolin conjugate افزوده میشود.

الف- تهیه لام یا اسلاید آنتی ژن شیزونت
آنتی ژن مورد استفاده برای schizont IFA test ازتیره سلولی شیزونت لیمفوبلاستوئید Lymphoblastoid گرفته میشود. كشتهای سلولی را كه دارای رقت ۲۰۰ میلی لیتر شیزونت در یك لیتر شیزونت های آلوده ( به T. parva ویا T. annulata بوده و حاوی ده میلیون سلول در هر میلی لیتر و حداقل ۹۰% سلولها آلوده میباشند ) باشد را سانتریفیوژ كرده ( بمدت ۲۰ دقیقه در سرعت ۲۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه ) و مایع روئی را دور ریخته و سلولهای ته نشین شده را با ۱۰۰ میلی لیتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دمای ۴ درجه و pH ۷.۲ تا ۷.۴ مخلوط و دوباره سانتریفیوژ میكنیم. این روش شستشو را سه بار تكرار كرده و در آخرین با رسلولهای ته نشین شده را با ۱۰۰ میلی لیتر PBS مخلوط كرده تا غلظت نهائی حدودCELL/ML ۷ ۱۰ درآید.
گسترش نازك از محلول سلولی را روی اسلاید حفره دار ( از جنس تفلن )‌تهیه كرده ویا روی لام معمولی را با استفاده از لاك ناخن تقسیم كنیم . هر گسترش باید دارای ۵۰ تا ۸۰ سلول سالم در هر دید میكروسكوپی Field ‌باشد (‌وقتیكه با بزرگنمایی ۴۰ با روغن Immersion بررسی شود) .بوسیله پی پت ۱۰۰�۹۵۶;l آنتی ژنها را با مكش یكدفعه روی لام ریخته كه پس از توزیع محلول شیزنت یا پیروپلاسم یك لایه Monolayer در هر كدام باقی می ماند. اینكار را برای هر حفره انجام داده تا مایع تمام شود. بااین روش تقریبا“‌می توان ۶۰۰لام با كیفیت خوب كه حاوی ۶ هزار سلول در هر نقطه آنتی ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشك كرده ودراستن بمدت ده دقیقه ثابت كرده (‌Fixation)‌ وبطور جداگانه دردستمال كاغذی پیچیده و سپس در كاغذ آلومینیم (‌فویل آلومینیم ‌) ‌وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردمای۲۰- درجه سانتیگرادیا ۷۰ - درجه سانتیگراد نگه می داریم . دردمای –۲۰ درجه سانتیگراد بمدت یكسال قابل استفاده هستند ودردرمای –۷۰ درجه سانتیگراد بمدت طولانی تر (‌دردمای یخچال ۴ درجه سانتیگراد بمدت چهارماه قابل نگهداری هستند).
ب- محلول آنتی ژن شیزونت
ابتدا ۵۰۰ میلی لیتر از محلول T.annalataیا T. parva سلولهای آلوده با غلظت ۱۰ ۶cell/ml سلول سانترفیوژكرده (‌در ۱۵۰ g دور دردقیقه برای ده دقیقه در دمای ۴ درجه )‌ وسلولهای ته نشین شده در۱۰۰سی سیPBS سرد دوبار شستشو می دهیم.
قابلیت زنده بودن سلولها را بوسیله اوزین Eosin یا Trypan blue بررسی میشود (‌كه باید بیش از %۹۰‌باشد )‌محلول سلولها باید درمحلول سرم فیریولوژی سرد رقیق شود تا غلظت ۷ ۱۰سلول (/ml Cell) بدست آید دراین حجم ، ‌دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوی ۸۰%‌ استن و ۰.۱ % فرمالین در PBS قطره قطره اضافه كرده (‌در درمای –۲۰ درجه )‌تا درمدت ۲۴ ساعت به تثبیت رسد.
سلولهای ثابت شده را سه بار شستشو داده (‌در سرم فیولوژی سرد شده دردمای ۴ درجه ) و‌در ۲۰۰ دور دردقیقه بمدت ۲۰ دقیقه سانترفیوژ میكنیم. بعد از آخرین شتشو سلولهای ته نشین شده را در سرم فیولوژی رقیق كرده تا غلظت ۱۰۷/ml بدست آید . بمیزان ۵/۰ سی سی سلولهای ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسیم می كنیم .



ترجمه و تنظیم : دكتر محمد سربی و دكتر حمید كشتمند


پارس بیولوژی